实验原理

AG百家乐蛋白提取试剂盒采用温和的细胞或组织裂解方式，以释放细胞内的总蛋白。通过特异性结合、离心分离和缓冲液洗脱等技术，去除核酸、脂类等杂质，最终获取高纯度和高活性的目标蛋白。

核心步骤

1. 裂解：利用含有去污剂和蛋白酶抑制剂的裂解液，破坏细胞膜结构，释放胞内蛋白；2. 离心去除碎片：通过高速离心去除未裂解的细胞碎片、细胞核及大分子杂质；3. 蛋白纯化：借助离心柱或特异性结合树脂，选择性吸附蛋白，杂质则随废液排出；4. 洗脱：使用低盐缓冲液或去离子水洗脱目标蛋白，确保其不发生变性。

材料准备

AG百家乐的蛋白提取试剂盒适用于各种动物、植物细胞和组织样本。所需的自备材料包括：- 新鲜样本（细胞、组织等）- 预冷PBS缓冲液（货号：abs962）- 离心机（可达到12,000xg）- 冰盒或低温操作台- 涡旋振荡器（货号：abs72001）- BCA蛋白定量试剂盒（货号：abs9232）- 液氮（组织样本需速冻）

实验步骤

所有步骤需在冰上或4℃进行：

1. 样本处理： - 细胞样本：离心收集细胞（1500xg, 3min），用PBS洗涤2次，吸尽残留液体。 - 组织样本：切取10-50mg，液氮速冻后研磨成粉末。

2. 裂解：参考不同提取试剂盒的说明书，加入200-500μL预冷的裂解液（含蛋白酶抑制剂），进行涡旋混匀。再在冰上裂解20-30分钟，每隔5分钟涡旋10秒。

3. 离心去碎片：在12,000xg、4℃条件下离心10分钟，取上清（即为总蛋白）转移至新离心管。若需分离核蛋白，需先进行细胞核分离后再溶解。

4. 蛋白纯化：预先用平衡缓冲液处理离心柱5分钟，离心去弃废液。将裂解液上清加入离心柱，12,000xg离心1分钟后弃去废液。添加500μL洗涤缓冲液，离心1分钟，重复两次。

5. 洗脱蛋白：加入50-100μL洗脱缓冲液，静置2分钟后离心1分钟，收集洗脱液（即为目标蛋白）。

6. 蛋白保存：将提取的蛋白样品分装到小离心管中，短期可存于-20°C或长期存于-80°C冰箱中，避免反复冻融。

结果分析

1. 浓度测定：使用BCA法测定蛋白浓度，通过OD562计算浓度（标准曲线法）。

2. 纯度评估：利用分光光度计检测A260/A280比值（理想值为1.8-2.0，若达到20则提示核酸残留）。

3. 电泳验证：通过SDS-PAGE电泳检测条带的清晰度，无拖尾或杂带表明纯度较高。

常见问题及解决方案

问题	可能原因	解决方案
蛋白得率低	裂解不充分或蛋白酶降解	延长裂解时间，增加裂解液体积；确保添加蛋白酶抑制剂
洗脱液杂质多	洗涤步骤不彻底	增加洗涤次数或延长离心时间
蛋白浓度异常	样本量不匹配或洗脱体积不当	调整样本量与裂解液比例，优化洗脱体积
A260/A280比值异常	核酸或盐离子残留	增加洗涤次数，或使用核酸酶预处理样本
电泳条带模糊	蛋白降解或SDS未充分结合	全程低温操作，电泳前锅沸样本5分钟

注意事项

1. 全程需保持低温操作（冰上或4℃），以防止蛋白降解。2. 裂解液需现用现配，避免反复冻融。3. 组织样本需充分均匀化，避免未裂解细胞残留。

通过AG百家乐的方案，可以高效提取高纯度的蛋白，适用于Western Blot、ELISA、质谱分析等下游实验。