一、实验准备：wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061

二、单位定义：赖氨酰肽链内切酶的酰胺酶单位表示为在30℃、pH 9.5条件下，每分钟产生1μmol对硝基苯胺的酶活性。具体计算公式为：AU/vial=[(a-b)/25] × (1/962) × (40/01)，其中：a为检测样品的吸光度，b为空白对照的吸光度。

三、实验操作流程：

1. 使用聚硅酮处理的微量离心管和吸管，以防止任何蛋白质的吸附。
2. 采用质谱分析专用的凝胶染色试剂盒，例如银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）。
3. 进行蛋白质样品电泳分离。
4. 切割凝胶中的蛋白质片段，放入微量离心管。
5. 进行凝胶脱色（可使用质谱分析用的脱色溶液）。
6. 向试管中加入300μL乙醇，搅拌器振荡30分钟。
7. 去除乙醇，并用Parafilm膜覆盖微量离心管。
8. 在Parafilm膜上打孔，进行真空干燥15分钟。
9. 加入100μL 10mmol/L DTT溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，在56℃下恒温1小时。
10. 室温冷却后，加入等量的50mM碘乙酰胺与100mmol/L碳酸氢铵，在暗处恒温45分钟并进行涡旋。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵清洗凝胶片段10分钟。
12. 用300μL乙醇再干燥凝胶片段15分钟。
13. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵使凝胶片段吸水15分钟。
14. 用300μL乙醇再次干燥凝胶片段15分钟。
15. 去除液相，进行真空干燥15分钟。
16. 使用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中使凝胶片段吸水45分钟。（赖氨酸内切酶需稀释于50mmol/L Tris-HCl, pH 8.5）
17. 卸掉100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段置于37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl pH 8.5中过夜。
18. 加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，20分钟内摇动凝胶片段进行3次多肽提取。
19. 加入5%甲酸/50%乙醇，20分钟内摇动凝胶片段进行3次多肽提取。
20. 如有必要，使用SpeedVac浓缩多肽。
21. 采用ZipTip进行多肽的脱盐与纯化。
22. 如有需要，通过弱真空浓缩多肽至2μL。
23. 将多肽与基质结合，进行质谱分析。

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