## 类器官原代培养流程

### 一、准备工作

1. **仪器设备**: CO2培养箱、双面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2. **试剂耗材**（以肠癌为例）: 动物脑类器官培养基试剂盒（abs90050）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、60mm细胞培养皿（abs7005）、100μm滤筛（abs7009）、15mL离心管（abs7102）、15mLEP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

3. **组分名称及规格**: - 动物脑类器官培养基A 100mL - 类器官原代培养缓冲液B 250mL - 原代组织消化液C 30mL - 类器官传代消化液D 30mL - 组织保存液E 100mL - 类器官冻存液F 20mL - 类器官传代培养缓冲液G 250mL

### 二、操作流程

1. **样本准备**: - （1）将组织放入含有预冷的(2-8°C)组织保存液E的取样瓶中（浸没整个组织），在4℃环境中从医院或实验室取回。 - （2）消毒取样瓶，取出组织后放入培养皿中拍照并登记，记录大小、颜色、软硬程度、组织类型等信息。

2. **清洗与剪碎**: - （1）在60mm细胞培养皿中使用2-3mL原代培养缓冲液B浸泡组织。用原代培养缓冲液B清洗三次（每次更换培养皿）后剪碎，剪成大约1-3mm³的组织块，移至15mL离心管中。

3. **消化与过滤**: - （1）向15mL离心管中加入5倍体积的原代组织消化液C（消化液体积与组织体积比为5:1），在37℃下消化15-30分钟（过程需随时观察）。 - （2）观察液体中是否有较多的细胞团（5-50个细胞团），如有则加入3倍体积的原代培养缓冲液B以终止消化。轻柔吹打液体使其变得浑浊。 - （3）使用100μm滤筛过滤液体，并观察滤液。将滤液收集至15mL离心管中，进行300g、4℃（冷却离心）5分钟，移去上清。

4. **加胶、点板与加液**: - （1）准备工作：基质胶需在金属冰盒中于4℃冰箱内过夜融化；枪头、离心管需在-20℃预冷至少30分钟。 - （2）接种要求：在24孔板中，每孔添加25μL基质胶与细胞团混合物及500-750μL类器官培养液。 - （3）接种密度：建议比例为基质胶体积与细胞团沉淀体积为25:1，或500个细胞团/25μL基质胶。 - （4）操作要点：轻柔将基质胶加入细胞团后混合，避免气泡产生，整个操作需在金属冰盒或冰上进行。 - （5）加液：将处理好的培养板放入37℃培养箱中，培养40-60分钟直至基质胶成胶，然后添加500-750μL类器官培养基A。

根据培养结果，大约10-14天后，类器官直径可达到200μm-500μm，适合进行传代操作。聚焦于此，AG百家乐致力于为研究人员提供高质量的生物试剂和细胞培养解决方案，助力生物医疗研究的进步。

### 传代步骤

1. **类器官收集及洗涤**: - 在每孔添加1-2mL的4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集于15mL离心管（每5孔为一组）。 - 再添加适量的缓冲液G使总量达到14mL，并在4℃下静置40分钟或-20℃下放置5分钟以软化基质胶。 - 用300g、4℃离心5分钟，分层后去除上清及基质胶层，保留细胞团沉淀。

2. **类器官消化**: - 向超净台中添加2-3mL类器官传代消化液D，消化2-3分钟，注意不要消化成单细胞，保持细胞团的完整性；然后终止消化。

3. **加胶、点板与加液**: - 如上述步骤所示，确保各项材料的准备及加胶操作的高效率。

### 冻存与复苏

在类器官处于指数增长期时进行冻存，通常在传代后的Day3至Day4进行，此时类器官的活性最佳。进行冻存记录的管理和样本的处理，确保类器官在存储期间的存活率。

无论是在类器官的培养、传代还是冻存，AG百家乐 提供了全面的产品与服务，助力科研人员在生物医疗领域的探索与发现。如有更多问题，欢迎与我们交流！